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Introdução

    O uso de suplementos alimentares, bem como o número de academias, tem aumentado significativamente nos últimos anos. Frequentadores de academias têm usado substâncias a fim de promover um aumento de sua potência muscular. Porém, muitos jovens utilizam tais substâncias sem prescrição medica e/ou orientação de um nutricionista qualificado.

    Jovens fisicamente ativos são os usuários mais frequentes de suplementos e hormônio do crescimento (GH) e podem enfrentar riscos (1-3).

    Suplementos alimentares são definidos como substâncias utilizadas por via oral com o intuito de complementar uma determinada deficiência dietética. Muitas vezes eles são comercializados como substâncias ergogênicas capazes de melhorar ou aumentar o desempenho físico (4). Dentre os suplementos utilizados, as proteínas e os aminoácidos estão entre os mais comuns, pois as proteínas fornecem a base estrutural de tecidos e órgãos (5).

    O uso de proteínas do soro do leite ou Whey protein tornou-se popular nas últimas décadas. As proteínas do soro são extraídas da porção aquosa do leite, gerada durante o processo de fabricação do queijo (6).

    O GH é utilizado principalmente por atletas de modalidades que requerem mais força, como lutadores e velocistas (7). Apesar de não haver evidência suficiente que comprove a eficácia do GH para melhorar o desempenho esportivo (8), muitos estudos afirmam que entre os benefícios do uso deste hormônio anabólico está a promoção do aumento do volume e potência muscular (9).

    O GH e o Whey protein são substâncias constituídas por aminoácidos. Sabe-se que os aminoácidos têm um importante papel na ansiedade e na memória, onde o triptofano e o glutamato são os que estão mais envolvidos nesses mecanismos, respectivamente. No entanto, há escassez de estudos relacionando possíveis efeitos que podem ser acarretados à memória e à ansiedade através do uso desses suplementos. Portanto, o presente estudo objetivou avaliar possíveis alterações na memória e ansiedade induzidas pela administração oral de GH e Whey protein.

Métodos

Animais

    Foram utilizados 30 ratos machos da linhagem Wistar, pesando aproximadamente 250g, com idade média de 60 dias, provenientes do Biotério da Universidade Feevale, Rio Grande do Sul. Os animais foram alojados neste biotério em caixas de polipropileno e distribuídos em cinco animais por caixa a fim de evitar mudanças comportamentais. Estes permaneceram em sala com temperatura controlada (22±2°C) e fotoperíodo cíclico de 12 horas com acesso à água ad libitum e ração comercial Nuvilab®.

    Os protocolos de pesquisa foram realizados segundo os princípios de bioética descritos na revisão da declaração de Helsinque e de acordo com a resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde, aprovado pelo CEP Feevale sob o nº 2.08.03.09.1595.

Procedimento

    Os animais foram divididos aleatoriamente em três grupos com 10 animais cada. Os animais do primeiro grupo foram utilizados como controle, onde foram administrados 0,2mL de água. O segundo grupo recebeu 0,5mg/kg/dia (10) de GH Advanced®, da marca Renewal, enquanto o terceiro grupo recebeu 1,4 g/kg/dia (11) de Liquid Amino®, da marca Probiótica. A dieta foi mantida por 60 dias, sendo que os ratos receberam tal por gavagem uma vez por dia durante seis dias da semana.

    A avaliação comportamental foi realizada utilizando-se a arena em campo aberto e labirinto em cruz elevado.

Campo aberto

    O teste do campo aberto foi descrito originalmente por Hall em 1941 para testar os efeitos de ambientes não familiares sobre as reações emocionais de ratos (12). Recentemente, o teste tem sido utilizado para realizar estudos de fenômenos cognitivos em animais, como: representação interna, mapeamento cognitivo, memória espacial e aprendizagem.

    Para analisar a atividade exploratória e locomotora, bem como a memória de habituação, os animais foram colocados individualmente no quadrante superior direito da arena de campo aberto, de tamanho 50 x 50 x 39 cm (comprimento x altura x profundidade), de paredes altas, feitas de madeira compensada com uma parede frontal de vidro. O soalho do campo aberto é dividido em 12 quadrantes iguais marcados com linha preta. O número de cruzamentos – resposta locomotora – e o número de elevações – resposta exploratória – foram mensurados por cinco minutos (sessão de treino). Estudos anteriores demonstram que esse tempo é o suficiente para indicar diferenças entre os grupos tratados, e caso o teste durasse mais tempo, os ratos se habituariam ao aparato ocasionando a diminuição da diferença entre os grupos analisados (13). Após 24 horas, os animais foram submetidos à arena novamente para a livre exploração por outros cinco minutos (sessão de teste). Os mesmos parâmetros foram mensurados para avaliar a habituação do animal ao ambiente (14). A diminuição do número de cruzamentos e elevações entre as duas sessões mostra a tendência natural do animal em explorar menos a arena, sendo indicativo de melhora da memória. Um cruzamento foi registrado quando o animal colocou as quatro patas no quadrante.

    A arena foi limpa com álcool a 30% após cada animal ser retirado, para evitar que o cheiro de urina e fezes interferisse no teste.

Labirinto em cruz elevado

    O labirinto em cruz elevado é o modelo animal de ansiedade mais utilizado. Esse equipamento é formado por quatro braços elevados e opostos. Dois braços possuem paredes, sendo chamados de braços fechados, enquanto os outros dois braços não possuem as paredes, sendo assim chamados de abertos. O uso do labirinto baseia-se na aversão natural dos roedores a espaços abertos.

    Os ratos foram expostos ao labirinto por cinco minutos e as sessões foram registradas concomitantemente. Ao início do experimento, os animais foram sempre colocados no centro do aparato com a cabeça voltada para um dos braços abertos. Posteriormente, foram analisados o número de entradas nos braços abertos/fechados e o respectivo tempo de permanência em ambos. Uma entrada foi registrada quando o animal colocou as quatro patas dentro de um dos braços.

    O aparato foi limpo com álcool a 30% após cada animal ser retirado, para evitar que o cheiro de urina e fezes influenciasse no teste.

Análise estatística

    Os dados foram armazenados e analisados em um banco de dados do SPSS 12.0. Os dados obtidos do campo aberto e do labirinto em cruz elevado são reportados como média ± erro padrão da média (EPM) e foram analisados por ANOVA two way seguido por teste de Tukey. As diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05.

Resultados

Campo aberto

    Conforme ilustrado na figura 1, não houve diferença significativa no número de cruzamentos entre os grupos GH (23,2±5,5) e Whey protein (26,1±5,5) quando comparados ao grupo controle (36,0±7,1) na sessão treino. Na sessão teste, não ocorreu diferença significativa no grupo GH (13,6±4,8) quando comparado ao grupo controle (27,0±8,3), diferentemente do observado no grupo Whey protein (6,8±2,5), onde houve diferença significativa (p<0,05). Cada grupo foi composto por 10 animais. Por conseguinte, pode-se constatar uma melhora da memória do grupo Whey protein.

Efeitos da administração de GH e Whey protein no campo

aberto em relação ao número de cruzamentos

Figura 1. Observa-se uma diferença significativa no grupo Whey protein quando comparado ao grupo controle na sessão teste.

 **p<0,05 (ANOVA seguida do teste de Tukey). Dados expressos como média ± EPM. 

    Não foi verificada diferença significativa (p<0,05), no número de elevações entre os grupos GH (10,3±1,6) e Whey protein (11,3±2,0) quando comparados ao controle (10,3±1,6) na sessão treino, conforme observado na figura 2. O mesmo ocorreu na sessão teste onde tais grupos – controle (7,5±1,9), Whey protein (4,8±1,5) e GH (4,9±1,4) – não tiveram diferenças estatísticas entre si. Cada grupo foi composto por 10 animais.

Efeitos da administração de GH e Whey protein no campo

aberto em relação ao número de elevações

Figura 2. Não houve diferença significativa entre os grupos GH e Whey protein quando 

comparados ao grupo controle em ambas as sessões. Dados expressos como média ± EPM

Labirinto em cruz elevado

    A administração de GH e Whey protein não alterou o número de entradas nos braços abertos e fechados, bem como o tempo de permanência (Tabela 1), não promovendo assim mudanças significativas (p<0,05) entre os grupos. Logo, o Whey protein e o GH não alteraram a ansiedade dos animais neste estudo, mostrando assim que essas substâncias não apresentam efeitos ansiolíticos ou ansiogênicos em ratos quando comparado com o grupo controle.

Tabela 1. Efeitos da administração de GH e Whey protein no labirinto em cruz elevado

Tabela 1. Não foi verificada diferença significativa entre os grupos (p<0,05). Os valores estão expressos como média ± EPM

Discussão

    Suplementos protéicos estão entre os mais comumente utilizados por atletas e indivíduos fisicamente ativos. Eles têm sido recomendados para atletas que objetivam aumentar sua massa muscular, prevenir o catabolismo protéico durante o exercício prolongado, prevenir a fadiga, entre outros. Entretanto, se os atletas precisam de mais proteína ou não é controverso. Estudos demonstram que mesmo se os atletas precisam de mais proteínas, as quantidades recomendadas podem ser facilmente obtidas da dieta. Em geral, suplementos protéicos não são necessários (15).

    Nesse estudo, onde a memória e a ansiedade foram analisadas em ratos que receberam doses de GH e Whey protein, foram observadas diferenças significativas entre o grupo Whey protein quando comparado ao grupo controle em relação à memória.

    A memória foi avaliada nesse experimento utilizando o campo aberto. Após a habituação, há uma tendência natural de o animal explorar menos o ambiente. Dessa forma é possível avaliar se em relação ao grupo controle os animais exploram menos o campo aberto – melhora da memória – ou exploram mais – indicativo de que desconhecem o local pelo prejuízo da memória. Nessa pesquisa, o grupo que recebeu doses de Whey protein apresentou uma melhora da memória quando comparados ao grupo controle.

    Entre os possíveis aminoácidos que poderiam afetar a memória estão aqueles que possuem cadeia ramificada (BCAA) – leucina, isoleucina e valina. Alguns estudos não mostram efeito da suplementação com BCAA no desempenho, bem como prevenção da fadiga durante o exercício prolongado (16-17). Estudos similares com BCAA sugerem que não há evidência da melhora do desempenho cognitivo e humor, diferentemente do encontrado nesse estudo, no qual o grupo que recebeu Whey protein obteve uma melhora na memória.

    Entre os diversos neurotransmissores, o glutamato, o ácido gama amino butírico (GABA), a dopamina, a noradrenalina, a serotonina e a acetilcolina, são citados por serem considerados os principais neurotransmissores envolvidos com os processos de memória (18). A tirosina também possui um papel como precursor desses neurotransmissores (19).

    O glutamato é sintetizado a partir da glutamina, por ação da enzima glutaminase, exercendo ações excitatórias e está envolvido em diversas atividades fisiológicas, entre elas, o aprendizado, a memória e a ansiedade (20). Ele participa de alterações na transmissão sináptica e é encontrado em vesículas sinápticas para ser liberado de maneira dependente do cálcio ou como precursor do GABA em sinapses inibitórias (21). Desta forma, os aminoácidos presentes no Whey protein poderiam estar interferindo nos processos cognitivos, visto que a disponibilidade dos aminoácidos favorece a síntese protéica a qual é necessária para a plasticidade sináptica (18). No entanto, novos estudos devem ser realizados para melhor compreensão dos mecanismos envolvidos nos processos de aprendizado e memória utilizando novos testes e doses para se estabelecer uma melhor relação entre Whey protein e memória.

    Bem como a memória, a ansiedade também foi avaliada nesse experimento. Não foram observadas mudanças entre os grupos quando comparados ao grupo controle em relação à ansiedade. A medida mais comum de evidenciar a ansiedade é a frequência de entradas e tempo de permanência no braço aberto. O número de entradas e tempo gasto nos braços abertos é usado como indicadores inversamente relacionados à ansiedade: quanto mais intensa a exploração dos braços abertos, menor a ansiedade (22). Assim, como os grupos exploraram de maneira igual o labirinto, pode-se dizer que as substâncias analisadas não interferem na ansiedade.

    É relatado que entre os aminoácidos envolvidos na ansiedade, estão o triptofano e o glutamato. O triptofano é utilizado na suplementação para aumentar a secreção de serotonina na tentativa de aumentar a tolerância à dor durante o exercício intenso (15).

    A serotonina é derivada do triptofano, que é veiculado pela dieta através de alimentos ricos em proteínas (23). Tem sido demonstrado que o nível de serotonina cerebral depende do triptofano livre no plasma (24). O uso de precursores de neurotransmissores como suplementos dietéticos, tanto em humanos quanto em animais, tem apresentado profundos efeitos na neuroquímica e comportamento (25). A serotonina pode aumentar a ansiedade atuando na amígdala e conter o pânico agindo na matéria cinzenta periaquedutal (26). Existem, tanto em humanos como em animais (ratos e macacos), evidências de que a síntese de serotonina cerebral possa ser modulada dieteticamente através da oferta de macronutrientes, destacando-se principalmente a ingestão de carboidratos, proteínas e aminoácidos isoladamente (27-29).

    O glutamato tanto tem papel na ansiedade, que estudos tem sido realizados a fim de investigar se compostos com ação na transmissão do glutamato poderiam ostentar algum efeito ansiogênico em animais (21). No entanto, o aporte extra de aminoácidos administrados nos animais nesse estudo, não mostrou efeitos ansiolíticos ou ansiogênicos.

    Entretanto, mais pesquisas devem ser conduzidas em relação ao uso dessas substâncias, considerando diferentes doses, tempo de tratamento e exposição ao exercício físico para avaliar os possíveis efeitos do GH e Whey protein na ansiedade.

Agradecimentos

    Os autores agradecem à Universidade Feevale pela infra-estrutura cedida, que possibilitou a realização do estudo.

Referências

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