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Introdução

    A ação do ultra-som de baixa intensidade na regeneração óssea vem sendo investigada em experimentos animais e clínicos no Brasil e no exterior. Tais investigações resultaram em uma tecnologia não invasiva para tratamento de fraturas que foi aprovada pelo Food and Drug Administration (FDA-EUA).¹ O FDA aprovou o uso em 2004 baseado em dois ensaios clínicos, duplo-cegos e controlados realizados por Heckman et al.² e Kristiansen et al.³ que mostraram que o ultra-som promove a aceleração do processo de cura de fraturas. De acordo com tais estudos, dados sólidos demonstram que o ultra-som tem uma forte influência positiva sobre os três estágios básicos do processo de cura (inflamação, reparo e remodelação), por realçar a atividade angiogênica, condrogênica e osteogênica⁴.

    Segundo Carvalho et al.⁵, o ultra-som é uma forma de energia mecânica que se propaga por ondas de pressão acústica. Essas têm a capacidade de provocar microdeformações na região óssea estimulada, gerando estímulos para acelerar ou iniciar o processo osteogênico.

    Segundo Wu e Du⁶, quando o ultra-som é aplicado sobre os tecidos, a energia ultra sônica é absorvida de acordo com a densidade tecidual, sendo que essa absorção também resulta em conversão de energia em calor. Embora tal efeito de aquecimento seja extremamente pequeno, algumas enzimas, como as colagenases, são sensíveis a pequenas variações na temperatura⁷. Além disso, segundo Kamamura, Matsuda e Kumamoto⁸, parte da energia incidente é refletida, resultando em gradientes complexos de pressão acústica através do tecido.

    Dionísio e Volpon⁹, Young¹⁰ e Carvalho et al.⁵ afirmam que o ultra-som de baixa intensidade age sobre as células colagenosas, tecido muscular e no aumento do fluxo sangüíneo.

    Estudos foram realizados com o intuito de investigar a influência desse tipo de energia nos processos biológicos. Ryaby et al.¹¹ relataram que o ultra-som de baixa intensidade aumentou a incorporação de cálcio na cultura de células ósseas e cartilaginosas, refletindo em mudança no metabolismo celular. Esse acréscimo foi paralelo à modulação da atividade da adenil ciclase e transformação da síntese de fator de crescimento beta em células osteoblásticas. Parvizi et al.¹² utilizando ultra-som para estimular condrócitos primários em ratos observaram uma elevação da concentração de cálcio intracelular, e sugeriram através desses resultados que o ultra-som estimula a síntese de proteoglicanos, que estaria associada ao processo de cura das fraturas, sendo esta síntese mediada pela sinalização do cálcio intracelular. Esse aumento na síntese de proteoglicanos pode explicar o papel do ultra-som na aceleração da ossificação endocondral, aumentando a força mecânica das fraturas e facilitando o processo de reparo¹³.

    Kokubu et al.¹⁴ expondo osteoblastos de ratos ao ultra-som pulsado de baixa intensidade (0,03W/cm²) verificaram que a produção de prostaglandina E (PGE₂) foi aumentada e, então investigando a expressão da ciclooxigenase-2 (COX-2), enzima crítica para a produção de PGE₂, observaram que este era capaz de regular rapidamente a sua expressão. Segundo os autores, tais resultados fornecem uma forte evidência que a produção de PGE₂ em osteoblastos é dependente da indução da expressão da COX-2 pelo ultra-som e fornecem um mecanismo para compreender a aceleração do reparo de fraturas com a sua utilização.

    Rawool et al.¹⁵ verificaram através de Doppler-sonografia o aumento do fluxo sanguíneo em torno do local da fratura em cães tratados com ultra-som em comparação aos controles.

    No Brasil, apesar do uso do ultra-som para tratamento de fraturas já ter sido aprovado pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), existem poucos estudos referentes ao assunto e o seu uso na prática clínica ainda não é rotina. Portanto, este estudo buscou analisar a osteogênese de lesão induzida experimentalmente da asa ilíaca de ratos tratada por ultra-som contínuo e pulsado de baixa intensidade.

Método

Amostra

    Foram utilizados 45 ratos, machos, da raça wistar (Norvergicus albinus), com idade de 70 dias, peso médio de 300 gramas, saudáveis, provenientes do Biotério Central da Universidade de Passo Fundo – RS. Os animais foram mantidos em gaiolas plásticas, forradas com maravalha peneirada, adaptados as condições de manejo e com alimentação ad libitum.

Procedimento cirúrgico

    Os procedimentos cirúrgicos foram realizados na Sala de Técnica Cirúrgica do Hospital Veterinário da Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária da Universidade de Passo Fundo por Médicos Veterinários.

    Os animais foram contidos manualmente e submetidos à anestesia geral com Cloridrato de Cetamina 15mg/Kg^-1 IM e Xilazina 5mg/Kg^-1 IM. Após os animais demonstrarem ausência dos reflexos motores e de reflexo a dor, verificado através de pinçamento interdigital, foram submetidos ao procedimento cirúrgico.

    Foi realizada a tricotomia da região da asa ilíaca e a anti-sepsia foi realizada com iodo polivinil-pirrolidona em veículo aquoso. A incisão cutânea foi procedida sobre a asa ilíaca direita, seguida de divulsão tecidual com auxílio de uma tesoura de Metzenbaum romba. Alcançando-se o periósteo, promovendo-se a perfuração do mesmo com Fio de Steiman de 3mm de diâmetro.

    A dermorrafia foi efetuada com nylon monofilamentar 6-0 em padrão interrompido simples. Administrou-se uma dose de Penicilina Benzatina (40.000 UI/kg^-1 IM) no pós-operatório imediato e Cetoprofeno (2 mg/Kg^-1, SC, SID durante três dias).

Grupos:

    Após a cirurgia os animais foram divididos de forma aleatória em três grupos, cada grupo contendo 15 animais. O grupo 1 (G1) foi submetido à terapia placebo, onde o movimento de aplicação da terapia com ultra-som era executado com o aparelho desligado, enquanto os grupos II (G2) e III (G3) receberam aplicação de ultra-som contínuo e pulsado, respectivamente.

    Cada grupo foi subdividido em três subgrupos de cinco animais (G1 subdivido em: A6, A16 e A26; G2 subdividido em: B6, B16 e B26; G3 subdividido em: C6, C16 e C26). Estes foram eutanasiados no 6°, 16° e 26° dias de pós-operatório, sendo que nesse dia não foram realizados os tratamentos.

Aplicação do ultra-som

    O aparelho de ultra-som utilizado foi o Pró-Seven, Quark®. Para a aplicação do ultra-som foi utilizado gel como meio de contato e condução, sendo os ratos contidos manualmente sob uma mesa.

    Os animais do G2 iniciaram o tratamento 24 horas após o procedimento cirúrgico, sendo que este foi ministrado diariamente por 10 minutos. O modo de estimulação utilizado foi o contínuo, com freqüência de 1 MHz, intensidade 0,14W/cm² na forma não estacionária. No subgrupo B6, a aplicação foi feita do primeiro ao quinto dias pós-operatório. No subgrupo B16 do primeiro ao décimo quinto dias pós-operatório e no grupo B26 do primeiro ao 25º dia pós-operatório.

    Os animais do G3 também iniciaram o tratamento 24 horas após o procedimento cirúrgico, sendo o mesmo ministrado diariamente por 10 minutos. O modo de estimulação utilizado foi o pulsado 10% - 100Hz, com freqüência de 1 MHz, intensidade de 0,03W/cm² na forma estacionária. No subgrupo C6 a aplicação foi realizada do primeiro ao quinto dia pós-operatório, no subgrupo C16 do primeiro ao décimo quinto dia pós-operatório e no grupo C26 do primeiro ao 25º dia pós-operatório.

    Os animais do G1 receberam a mesma manipulação que os grupos 2 e 3, porém com o aparelho de ultra-som desligado.

Eutanásia:

    Foi administrado cloridrato de xilazina (5mg/Kg^-1, IM) e sulfato de morfina (1mg/Kg^-1, IM) para relaxamento muscular e analgesia. A eutanásia foi realizada com sobredose de anestésico tiopental sódico (100mg/Kg^-1, IP) após o efeito da pré-medicação.

    Por meio de incisão de pele com bisturi no 24, divulsionou-se o tecido subcutâneo com o auxílio de uma tesoura de Metzenbaum. Os músculos adjacentes à asa do ílio foram então incisados com bisturi, alcançando assim a cavidade abdominal na porção ventral. O corpo do ílio, o ramo cranial do púbis e a articulação sacroilíaca foram isolados com o auxílio de uma tesoura de Maio romba, sendo acondicionas as peças, de acordo com o grupo a que pertenciam, em recipientes contendo Formol tamponado a 10%, visando uma proporção de 10 vezes o volume de Formol em relação à peça.

Técnica histopatológica

    Foi realizada no Laboratório de Patologia do Hospital Veterinário da Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária da Universidade de Passo Fundo (UPF), por médica veterinária.

    As amostras da asa do ilíaco foram fixadas em formalina tamponada a 10 % por 48 horas. Posteriormente, foram descalcificadas em solução de ácido fórmico por cinco dias. Após esse período, foram clivadas e desidratadas em álcool ascendentes (bateria histotécnica), colocadas em xilol e embebidas em parafina. Posteriormente foram incluídas em parafina para a confecção dos blocos, por dois dias. Foram então cortados ao micrótomo a 5m e as lâminas confeccionadas e coradas com hematoxilina e eosina. Foram realizadas três leituras cegas para que não houvesse indução de resultados.

    Este trabalho por estar de acordo com os princípios éticos no uso de animais na experimentação científica foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade de Passo Fundo registrado na Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP).

Resultados

Análise Histopatológica referente ao quinto dia de tratamento

    O grupo 3, tratado com ultra-som pulsado, apresentou intensa neovascularização e infiltração de tecido conjuntivo frouxo, assim como discretas áreas hemorrágicas. No local da incisão não havia periósteo, apenas tecido conjuntivo e eram discretos os sinais de regeneração óssea. No grupo 2, tratado com ultra-som contínuo, apareceram grandes áreas de hemorragia e edema, porém estavam presentes sinais de regeneração óssea mais proeminentes que no grupo tratado com o ultra-som pulsado.

    O grupo 1 (placebo) apresentou intensa infiltração de células inflamatórias polimorfonucleares (indicação de fase aguda presente quando comparado com os grupos tratados). Havia osteogênese menos pronunciada e infiltração de tecido conjuntivo frouxo em menor grau do que os grupos tratados.

Análise histopatológica referente ao décimo quinto dia de tratamento:

    O grupo 2 mostrou trabéculas ósseas aumentadas de tamanho, e numerosos osteoblastos e condroblastos. O periósteo da região da incisão encontrava-se com largura aumentada, sendo raros os osteoclastos e tecido conjuntivo denso.

    No grupo 3 havia mais tecido conjuntivo que no Grupo 2, sendo esta a única diferença histopatológica entre os dois grupos.

    O que diferenciou o grupo 1 dos demais é que as trabéculas e o periósteo da região estavam mais finos, o que indicava um calo ósseo menor. Não havia presença de osteoclastos.

Análise histopatológica referente ao 25° dia de tratamento

    O grupo 3 apresentou grande atividade osteoclástica na região da incisão, indicando estágio de remodelação. Em comparação com o grupo 1, havia menor número de osteoblastos e condroblastos ativos. Não houve diferença histopatológica entre os grupos 2 e 3.

    As amostras do grupo 1, placebo, apresentaram extensas áreas de ossificação na região da incisão, indicando a formação de calo ósseo. Era intensa a atividade osteoblástica e condroblástica, havendo raros osteoclastos.

Discussão

    Ryabi et al.¹⁶ utilizando ultra-som de baixa intensidade promoveram incremento do fluxo sangüíneo no local da fratura, sendo que o mesmo ocorreu no presente estudo, conforme os achados histopatológicos após cinco dias de tratamento, onde o ultra-som pulsado causou intensa neovascularização no local da lesão óssea. Contudo, nossos achados para o quinto dia mostraram que apesar do grupo tratado com ultra-som contínuo ter apresentado áreas de hemorragia e edema, a regeneração óssea foi mais proeminente do que no grupo tratado com ultra-som pulsado.

    A análise histopatológica a que foi submetido o grupo placebo após cinco dias, indicou osteogênese menos pronunciada que aquela identificada nos grupos tratados. De forma semelhante, Carvalho¹⁷ através de análise histológica do fêmur de ratas osteopênicas que receberam ultra-som de baixa intensidade, observou uma menor deterioração micro arquitetural para o grupo tratado quando comparado ao placebo, além da ocorrência de neoformação óssea no grupo tratado, o que não foi observado no grupo placebo.

    Ainda, Angles et al.¹⁸ investigaram o efeito do ultra-som de baixa intensidade (2, 15 e 30mW/cm²) sobre as características fenotípicas de células estromais oriundas da medula óssea de ratos que foram cultivadas sob condições definidas e observaram que após cinco dias, com tratamentos diários de qualquer uma das intensidades de ultras-som, ocorreu aumento da atividade da fosfatase alcalina, um indicador precoce de diferenciação de osteoblastos, em comparação com placebo, indicando que o ultra-som foi capaz foi capaz de iniciar a diferenciação osteogênica.

    Aos quinze dias, nossos resultados demonstraram que os animais do grupo tratado com ultra-som contínuo encontravam-se na fase de formação de calo ósseo devido à intensa atividade de osteoblastos e condroblastos, sendo identificada menor atividade de osteoclastos. Da mesma forma, Carvalho¹⁷ observou aumento da atividade osteoblástica constatada pela proximidade das células ósseas com as trabéculas no grupo de ratas tratadas e pela menor interação dos osteoblastos com a matriz óssea nas ratas submetidas à terapia placebo.

    Neste mesmo período os resultados do presente estudo demonstram que o grupo placebo apresentou calo ósseo menor quando comparado aos tratados. Também pela análise histológica, e ainda radiográfica, Duarte¹⁹ constatou em ossos osteotomizados tratados com ultra-som de baixa intensidade um rápido aumento do calo ósseo após dez a doze dias de tratamento, estabilizando após este período, sendo que o grupo placebo apresentou após quinze dias um lento aumento do calo ósseo.

    Dyson e Brookes²⁰ utilizaram ultra-som pulsado com intensidade de 0,5W/cm² em fraturas fibulares de ratos e por meio de análise histológica e micro radiológica, demonstraram aceleração no processo de reparo da fratura no grupo tratado quando comparado ao controle. Ainda, observaram que o ultra-som foi mais efetivo nas duas primeiras semanas após a injúria, ou seja, durante a fase inflamatória e o início da fase proliferativa do reparo.

    Os achados histopatológicos do 25° dia demonstram que os grupos tratados apresentam-se em fase de remodelação óssea, pelos muitos osteoclastos e poucos osteoblastos e condroblastos ativos, enquanto que no grupo placebo os animais iniciaram a fase de formação do calo devido à maior atividade osteblástica e condroblástica e raros osteclastos. De acordo com Thompson, Skinner e Piercy²¹ na fase de remodelação acontece a alteração da estrutura lamelar e reforço do osso ao longo das linhas de tensão. Além disso, osso excedente é removido de forma gradual, e geralmente, a estrutura óssea parece-se muito com a original.

    Azuma et al.²² investigando o uso do ultra-som pulsado de baixa intensidade em fraturas femorais de ratos em quatro diferentes períodos de tratamento (1º - 8º P.O.; 9º - 16º P.O.; 17º - 24º P.O.; 1º - 24º P.O.) constataram através de teste mecânico de torsão que o torque máximo para falência foi significantemente maior para todos os grupos tratados quando comparados ao controle. Entretanto, utilizando radiografia, tomografia computadorizada e análise histológica, mostraram que um tempo parcial de tratamento pode acelerar o processo de cura, porém um período longo de tratamento foi mais eficaz.

    Shimazaki et al.²³ investigando a utilização do ultra-som pulsado de baixa intensidade em coelhos submetidos à distração da tíbia verificaram que o ultra-som acelerou a maturação óssea mesmo em estados de pobre formação de calo ósseo. Resultados semelhantes também foram obtidos na distração de metatarsos de ovelhas²⁴.

    Ainda, corroborando com nosso achados Heckman et al.² avaliaram 67 fraturas de tíbia em estudo prospectivo, randomizado e duplo-cego para avaliar o uso do ultra-som no processo de reparo de fraturas e observaram que houve uma diminuição estatisticamente significativa no tempo clínico de cura (p=0,01) e no tempo total (clínico e radiográfico) de cura (p=0,0001) das fraturas tratadas quando comparadas ao grupo controle, demonstrando a eficácia do ultra-som de baixa intensidade na aceleração do processo normal de reparo de fraturas.

    De forma semelhante Kristiansen et al.³ conduziram ensaio clínico randomizado para testar a eficácia do ultra-som pulsado de baixa intensidade em reduzir o tempo de cura de fraturas distais do rádio. O tratamento ativo e o tratamento placebo iniciaram sete dias após a fratura e foram ministrados diariamente por 10 semanas. As avaliações clínicas e radiográficas foram realizadas na primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, oitava, décima, décima segunda e décima sexta semanas após a fratura. O tempo para união foi significantemente menor (p<0,0001) para as fraturas tratadas com ultra-som do que para aquelas que receberam terapia placebo. Cada estágio radiográfico da cura também foi significantemente acelerado no grupo que foi tratado com ultra-som comparado ao tratado com terapia placebo. Concluíram dessa forma que o ultra-som acelera a cura de fraturas da metáfise distal do rádio.

    Ainda, em uma meta-análise de experimentos randomizados e controlados do uso do ultra-som pulsado de baixa intensidade na cura de fraturas Busse et al.²⁵ concluíram que há evidências de que o ultra-som pulsado de baixa intensidade pode reduzir significativamente o tempo de cura de fraturas e poderia render economias de custo substanciais e diminuir a incapacidade associada a retardo da consolidação ou pseudoartroses.

Conclusão

    O grupo tratado com ultra-som contínuo apresentou sinais de regeneração óssea nos primeiros cinco dias mais evidentes quando comparado ao ultra-som pulsado ou a terapia placebo. Ao final do período de estudo observou-se que o ultra-som de baixa intensidade, pulsado ou contínuo, acelerou o processo de osteogênese em lesões na asa ilíaca de ratos. Portanto, acredita-se que o ultra-som de baixa intensidade é um recurso eletroterápico que pode ser utilizado na prática clínica com o intuito de acelerar o processo de reparo de fraturas.

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