Associação entre o polimorfismo do gene da óxido nitrico sintase na posição -786T>C com os níveis plasmáticos de triglicerídeos em mulheres Asociación entre el polimorfismo del gen de óxido nítrico sintasa en la posición -786T>C con niveles plasmáticos de triglicéridos en las mujeres
	Departamento de Educação Física Instituto de Biociências, UNESP, Rio Claro, SP (Brasil)	Iane de Paiva Novais | Guilherme Morais Puga Carlos Henrique Grossi Sponton | Pamella Araujo Mallagrino Rodrigo Degli Esposti | Pedro Renato Zaros Angelina Zanesco azanesco@rc.unesp.br
	Resumo           O óxido nítrico (NO), sintetizado a partir do aminoácido L-arginina pela enzima sintase do NO (NOS), desempenha um papel fundamental em uma variedade de funções celulares, tais como vasodilatação, inibição da agregação plaquetária, efeito antioxidante e antiproliferativo. Atualmente, a relação entre os genótipos eNOS e as doença cardiovasculares foram estudada em diferentes populações. Tem sido relatado que o polimorfismo do gene da eNOS na posição 5’ Flanking (–786T>C) do cromossomo 7 está positivamente associado com redução na expressão do RNA da eNOS e a produção de NO. Portanto, o objetivo deste estudo foi verificar a relação entre o polimorfismo do gene –786T>C da eNOS com o perfil lipídico e pressão arterial em mulheres de meia-idade.  Cento e cinquenta e cinco mulheres sobrepesadas/obesas foram recrutadas para este estudo e foram avaliados os parâmetros antropométricos, cardiovasculares e bioquímicos. Após jejum noturno de 12 horas, foram coletadas amostras de sangue para análise do perfil lipídico, glicemia e genótipo do polimorfismo do gene da eNOS. De acordo com o genótipo da eNOS dos sujeitos, eles foram divididos em 3 grupos: TT (n=54), TC (n=86) e CC (n=15). Nossos dados mostraram que as mulheres com o genótipo CC tinham níveis de triglicérides de aproximadamente 30% maiores (187±119 mg/dl) em comparação com o genótipo TC (130±54 mg/dl) e TT (134±66 mg/dl). Nenhuma diferença foi encontrada no colesterol total (205±73, 201±49 e 201±51 mg/dl, para mulheres com genótipo CC, TC e TT, respectivamente). Similarmente, os níveis de glicose sanguíneos não foram diferentes entre os genótipos dos grupos (96±32, 94±19 e 87±16 mg/dl, para mulheres com genótipo CC, TC e TT, respectivamente). Ambos os valores de pressão arterial sistólica (132±15, 127±18 e 126±18 mmHg, para mulheres com genótipo CC, TC e TT, respectivamente) e diastólica (85±10, 82±11 e 81±11 mmHg, para mulheres com genótipo CC, TC e TT, respectivamente) não foram diferentes entre os grupos de genótipos. Em conclusão, nosso estudo mostra maiores níveis de triglicérides no plasma foram associados positivamente com o genótipo CC do gene da eNOS na posição –786T>C em mulheres de meia-idade.           Unitermos: Oxido nítrico. Gene na posição –786T>C. Triglicerídeos em mulheres.   Abstract           Nitric oxide (NO), synthesized from the amino acid L-arginine by the enzyme NO synthase (NOS), plays a key role in a variety of cellular functions such as vasodilatation, inhibition of platelet aggregation, antioxidant and antiproliferative effects. Nowadays, the relationship between eNOS genotype with cardiovascular disease has been studied in different populations. It has been reported that eNOS gene polymorphism in the 5’ Flanking Region (–786T>C) of chromosome 7 is positively associated with reduction in eNOS RNA expression and NO production. Therefore, the aim of this study was to verify the relationship between the eNOS gene polymorphism –786T>C with the lipid profile and blood pressure in middle-aged women. A hundred and fifty-five overweight/obese women (59±8 yr) were eligible for this study. Anthropometric, cardiovascular and biochemical parameters were evaluated. After an overnight fasting, blood sample were collected for lipid profile, blood glucose and eNOS gene polymorphism genotype analysis. Based on the subject’s eNOS genotype they were divided in 3 groups: TT (n=54), TC (n=86) and CC (n=15). Our data showed that women with CC genotype had a higher triglycerides levels (187±119 mg/dl) in comparison with TC (130±54 mg/dl) and TT genotype (134±66 mg/dl), approximately 30%. No differences were found in total cholesterol (205±73, 201±49 and 201±51 mg/dl, for women with CC, TC and TT genotype, respectively), HDL (45±16, 47±12 and 50±13 mg/dl, for women with CC, TC and TT genotype, respectively), and LDL (136±67, 134±38 and 132±49 mg/dl, for women with CC, TC and TT genotype, respectively). Similarly, blood glucose levels were not different among genotype groups (96±32, 94±19 and 87±16 mg/dl, for women with CC, TC and TT genotype, respectively). Both systolic and diastolic blood pressure values were not different among genotype groups, systolic (132±15, 127±18 and 126±18 mmHg, for women with CC, TC and TT genotype, respectively), and diastolic (85±10, 82±11 and 81±11 mmHg, for women with CC, TC and TT genotype, respectively). In conclusion, our study shows the highest plasma triglycerides levels were positively associated with CC genotype for the eNOS gene at position –786T>C in middle-aged women.           Keywords: Nitric oxide. Gene at position –786T>C. Triglycerides in women.
	http://www.efdeportes.com/ Revista Digital - Buenos Aires - Año 15 - Nº 146 - Julio de 2010

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Introdução

    Atualmente, observa-se crescimento significativo no número de informações sobre as variações genéticas naturais presentes no genoma humano. Esse crescimento é atribuído a grande influência da genética sobre as doenças crônico-degenerativas. As variações naturalmente observadas na seqüência do DNA podem assumir diversas formas como: substituição de um único nucleotídeo (single nucleotide polymorphism - SNP), inserção ou deleção de únicos ou múltiplos nucleotídeos, mudanças no número de seqüências repetidas (variable number tandem repeats - VNTR) ou grandes mudanças na estrutura dos cromossomos (Balasubramanian, 2004). Dependendo da freqüência e ocorrência para o desenvolvimento de doenças, essas variações são classicamente definidas como: polimorfismos (freqüência > 1% na população normal) ou mutações (freqüência <1% normalmente resultando em uma patologia). Entretanto, este conceito apresenta algumas limitações, uma vez que nem todas as mutações resultam em doenças, e alguns polimorfismos são funcionalmente importantes, podendo estes estar envolvidos na fisiopatologia de algumas doenças (Balasubramanian, 2004).

    O óxido nítrico (NO) é uma das mais versáteis moléculas conhecidas, sendo considerado um importante regulador do sistema cardiovascular e endócrino-metabólicas, atuando como mediador em muitas reações biológicas (Melino et al., 1997). Sua formação se dá sob a ação de enzimas específicas conhecidas como NO sintases que atuam sobre o aminoácido L-arginina. Essas enzimas apresentam-se sob duas isoformas: a constitutiva e a induzível. As isoformas constitutivas são subdivididas em nNOS (NOS neural) e eNOS (NOS endotelial) encontradas nos neurônios e endotélio respectivamente. Já a isoforma induzível pode ser encontrada em macrófago, linfócitos, neutrófilos, eosinófilos, sendo essas isoformas codificadas por diferentes genes localizados em diferentes cromossomos (Moncada, 1991). O gene da eNOS está localizado no cromossomo 7 (Gen Bank D26607), mais especificamente no longo braço do cromossomo, na região 7q35-36, apresentando este um comprimento genômico de 4.4kb compreendendo 25 íntrons e 26 éxons, sintetizando um RNAm de 4052 nucleotídeos. A presença de polimorfismo no gene da eNOS tem sido associada a diversas doenças cardiovasculares como doença arterial coronariana, hipertensao e aterosclerose. No entanto, nenhum trabalho avaliou a interação entre a presença do polimorfismo no gene da eNOS na posição –786T>C e o perfil lipídico, glicemia e pressão arterial em mulheres de meia idade. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar o perfil lipidico, a glicemia e a pressão arterial em mulheres com ou sem polimorfismo para o gene da eNOS na posição –786T>C.

Metodologia

    Este estudo foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética de Pesquisa em seres humanos do Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho – UNESP (Protocolo n° 6603). Os participantes desse estudo foram convidados e selecionados segundo os critérios de inclusão dentro do campus de Rio Claro da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho – UNESP.

Critérios de inclusão

    Para serem incluídos no estudo, os participantes deveriam ser mulheres acima de 39 anos, não ser fumante; ter função renal normal (creatina sérica 0,6 a 1,4 mg/dL, especificado pelo kit Laborlab); ter um IMC < 34,9 kg/m2, evitando-se assim a interferência da obesidade II e III. Os participantes selecionados foram convidados a comparecem ao Laboratório de Atividade Física e Saúde da Mulher, os quais assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido que informava sobre os procedimentos e riscos da pesquisa e puderam ter qualquer dúvida esclarecida.

Avaliação Antropométrica e medida de pressão arterial

    O cálculo do índice de massa corpórea (IMC) foi realizado com base na avaliação antropométrica (peso e altura), levando em consideração a razão entre o peso corporal e o quadrado da estatura (kg/m2). Para a pesagem foi utilizada uma balança digital marca Plenna® estando os voluntários vestidos com o mínimo de roupa possível e descalços para a pesagem. A estatura foi mensurada através de uma fita métrica que foi fixada na parede.

    Nos dias determinados para aferição da pressão arterial, os voluntários foram instruídos para que não realizassem exercício físico. Pela manhã, a pressão arterial dos voluntários foi avaliada após 15 minutos de repouso na posição sentada utilizando um esfigmomanômetro aneróide (Tycos, Raleigh, NC, USA). Estas medições foram feitas pelo mesmo experiente avaliador durante três dias não consecutivos, como determina a Sociedade Brasileira de Hipertensão (2006).

Análise da glicose e do perfil lipídico

    Após jejum noturno de aproximadamente 12 horas, foi coletado da veia antecubital amostra sanguínea (13 ml) através da técnica asséptica com material de punção venosa, descartável e apropriado para a população estudada. Após a coleta sanguinea, 4 ml do sangue de cada voluntário armazenado em tubo de fluoreto foram destinados a análise da glicose plasmática através do kit enzimático colorimétrico (LaborLab, São Paulo, Brasil). Foram considerados elevados os valores maiores ou iguais a 100 mg/dL. Cerca de 5 ml do sangue coletado foram armazenados em tubos com coagulante e foram utilizados para a análise do perfil lipídico através do kit comercial Wiener (Rosário, Argentina).

Análise genotípica da NO sintase

    O DNA dos participantes foi obtido de 4 ml de sangue, mais especificadamente de leucócitos, a partir do protocolo Clorofórmio-Fenol. O sangue foi centrifugado a 2650 rpm por 10 minutos, o plasma descartado e os eritrócitos lisados com uma mistura de soluções contendo NH4Cl 0,144M e NH4HCO3 0,01M. Após centrifugação a fase aquosa foi desprezada e este último passo repetido mais duas vezes. A seguir, foi adicionado ao precipitado 1 ml da solução denominada TKM1 (Tris-HCl 10mM; pH 7,6; KCl 10mM; MgCl2 10mM; EDTA 20mM), juntamente com 1 gota de Triton X-100. As amostras, depois de homogeneizadas, foram centrifugadas a 2650 rpm por 10 minutos, e posteriormente a fase aquosa foi descartada, obtendo-se o precipitado de leucócitos.

    Para lisar os leucócitos, foram adicionados 400 ml da solução TKM2 (Tris-HCl 10 mM pH 7,6; KCl 10mM; MgCl2 10mM; NaCl 0,4M; EDTA 20mM) e 25ml de SDS 10% e incubado à 55ºC por 30 min. Após esse período, 180ml de NaCl 5M foram adicionados à solução anterior e mantida em temperatura ambiente por 15 minutos. A amostra foi centrifugada a 12.000 rpm por 5 minutos e a fase aquosa transferida para outro tubo, foram adicionados 400ml de fenol pH 8,0 e igual volume de uma solução clorofórmio/álcool isoamílico (proporção 24:1) para precipitação de proteínas, seguido de homogeneização, centrifugação e transferência da fase aquosa para outro tubo. Para a completa remoção de proteínas da amostra, 900ml da mistura clorofórmio/álcool isoamílico foram adicionados ao tubo, centrifugado e a fase aquosa transferida para um novo tubo. Para a precipitação do DNA, foram adicionados 10% do volume da fase aquosa de acetato de sódio 3M pH 5,2 e 900ml de etanol absoluto gelado. O tubo foi centrifugado a 12.000 rpm por 5 minutos, a fase aquosa foi desprezada e o DNA precipitado foi lavado com 1ml de etanol 70% gelado. Posteriormente o DNA foi solubilizado em 30ml de tampão Tris-EDTA (TE) estéril e armazenado em geladeira até o dia seguinte. O DNA foi quantificado em equipamento NanoDropâ ND-1000 (NanoDrop Technologies, Inc, WILMINGTON, DE, USA) e a análise qualitativa realizada em gel de agarose 1,0%.

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

    A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é uma técnica de amplificação de DNA in vitro e catalisada por uma enzima termoestável (Taq DNA polimerase), utiliza primers que se hibridizam em fitas opostas de regiões específicas do DNA, delimitando o fragmento. A reação é levada ao termociclador e a amplificação desta região, a partir de uma pequena quantidade de DNA, ocorre em decorrência dos repetidos ciclos de temperatura: 94-96ºC - desnaturação do DNA; aproximadamente 55ºC - anelamento dos primers, e 72ºC – extensão, etapa em que há a incorporação dos nucleotídeos, resultando em um acúmulo exponencial do fragmento. Os primers utilizados na PCR para a obtenção do fragmento que pode conter o polimorfismo para a posição -786 foram desenhados previamente. Após a confirmação da amplificação pela PCR em gel de agarose 1,5% através da eletroforese, foi realizada a técnica de RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) em que os fragmentos polimórficos amplificados foram digeridos pela MspI e analisados por eletroforese.M

    Após a digestão, são observadas as seguintes características para a região de interesse:

• Homozigoto não polimórfico (T/T) - 394pb;

• Heterozigoto Polimórfico (T/C) -394pb + 352pb + 42pb

• Homozigoto Polimórfico (C/C) - 352pb + 42pb

    Assim, a população estudada foi dividida em três grupos, denominados: TT, TC e CC.

Análise estatística

    Inicialmente, o teste de Kolmogorov-Smirnov foi utilizado para determinação da normalidade do conjunto de dados analisado, o qual indicou normalidade dos mesmos. utilizou-se análise de variância (ANOVA one-way), com teste post hoc de Tukey para a comparação das médias entre os genótipos polimórfico e não polimórfico . Os resultados foram analisados através do software SPSS 13.0 e o nível de significância adotado foi p < 0,05.

Resultados

    As características antropométricas, os valores de repouso de pressão arterial sistólica e diastólica e idade de todos voluntários estão apresentadas na tabela 1. Do total de 155 voluntárias, 9,7% apresentaram a característica de homozigoto polimórfico (genótipo CC), 55,5% apresentaram a característica de heterozigoto polimórfico (genótipo TC) e 34,8% apresentaram característica de homozigoto não polimórfico (genótipo TT).

Tabela 1. Caracterização das voluntárias agrupadas pela presença (genótipos TC e CC)

ou ausência (genótipo TT) de polimorfismo para o gene da ENOS na posição -T786C<

	Idade (anos)	PAS (mmHg)	PAD (mmHg)	Massa Corporal (kg)	Estatura (m)	IMC (kg/m2)
Genótipo CC (n=15)	61,7 ± 6,2	132,0 ± 14,8	84,8 ± 9,8	69,3± 13,0	1,6 ± 0,0	27,9 ± 5,2
Genótipo TC (n=86)	58,6 ± 8,5	126,6 ± 17,6	81,6 ± 10,7	68,0 ± 12,1	1,6 ± 0,1	27,1 ± 4,8
Genótipo TT (n=54)	57,7 ± 9,0	125,9 ± 17,6	81,3 ± 10,5	66,4 ± 11,0	1,6 ± 0,1	26,1 ±3,8

PAS, pressão arterial sistólica; PAD, pressão arterial diastólica; IMC, índice de massa corporal.

    Os resultados do perfil lipídico de todas as voluntárias, estratificadas pela presença ou ausência do polimorfismo para gene da eNOS na posição –786T>C estão apresentados nas figuras de 1. Não observamos diferença estatística entre os grupos TT, TC e CC para os valores de HDL-colesterol (CC: 44,8 ± 16,1; TC: 47,4 ± 11,8; TT: 49,7 ± 12,9 mg/dL), LDL-colesterol (CC: 136,5 ± 66,9; TC: 133,6 ± 37,8; TT: 132,1 ± 49,0 mg/dL) e colesterol total (CC: 205,1 ± 73,4; TC: 201,6 ± 39,6; TT: 201,3 ± 50,6 mg/dL). Já as concentrações sanguineas de triglicerídeos apresentaram menores valores nos grupos com genótipo TC e TT, aproximadamente 30% (TC: 130,2 ± 53,7 e TT: 133,6 ± 66,2mg/dL) em comparação com o grupo CC (186,9 ± 118,8mg/dL), P< 0,05.

Figura 1. Concentração plasmática de colesterol total (painel A), LDL colesterol (painel B), HDL colesterol ((painel C), e triglicerideos (painel D) para os 

genótipos CC, TC e TT do gene da eNOS na posição -786>C de mulheres. Os dados representam as médias ± SEM. * p<0,05 em relação ao grupo TT e TC.

    A concentração plasmática de glicose também não foi diferente entre os grupos, segundo o genótipo (CC: 96,3 ± 32,0; TC: 94,2 ± 18,9; TT: 86,6, ± 15,9 mg/dL), como mostrados na figura 2.

Figura 2. Concentração plasmática de glicose para os genótipos CC, TC e TT do

gene da eNOS na posição -786>C de mulheres. Os dados representam as médias ± SEM

Discussão

    Estudos prévios mostram associação positiva entre a incidência de doenças cardiovasculares e endócrina-metabólicas com a presença de polimorfismo para o gene da eNOS na posição –786T>C (MIYAMOTO et al., 2000; WANG & WANG, 2000). Além disso, estudo avaliando a reatividade vascular, verificaram que indivíduos com polimorfismo para o gene da eNOS para a posição –786T>C apresentavam redução da resposta vasodilatadora dependente do endotélio (ROSSI et al., 2003). Em nosso estudo não foi encontrada qualquer associação entre os valores de pressão arterial sistólica e diastólica e a presença de polimorfismo para o gene da eNOS na posição –786T>C. Estes dados reforçam resultados anteriores obtidos para outras populações, principalmente a japonesa (MIYAMOTO et al., 1998; KAJIYAMA et al.; 2000) e caucasianos (BENJAFIELD & MORRIS, 2000). Assim, a presença do polimorfismo para o gene da eNOS na posição –786T>C não influencia os valores de pressão arterial em mulheres.

    Quanto ao perfil lipídico, mulheres com genótipo CC para o gene da eNOS apresentaram maiores valores de triglicerídeos quando comparadas com àquelas com genótipo TT e TC. Estes dados sugerem que esse tipo de genótipo pode importância clínica no desenvolvimento de doenças cardio-inflamatórias como a aterosclerose e a doença arterial periférica na população estudada.

    Assim, nossos dados reforçam a importância de ações preventivas como dieta e prática de atividade física regular para mulheres com genótipo CC para o gene da eNOS na posição –786T>C para prevenir o aparecimento das doenças cardio-metabólicas.

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