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Introdução

    No esporte, a busca pela perfeição no desempenho físico é algo almejado em todas as categorias. Principalmente nas modalidades de “endurance”, que exigem um condicionamento potente, a fisiologia e bioquimismo do atleta são processos fundamentais1. Com o objetivo de um aumento artificial de seu desempenho, através de uma alta oxigenação tecidual, ocasionada por aumento do número total de eritrócitos, muitos esportistas se valem de práticas ilícitas, envolvendo um importante hormônio: a eritropoetina (EPO)^{1, 2}.

    O uso da EPO para doping surgiu na década de 70, através do condicionamento dos atletas a câmaras hipobáricas (o que induz aumento da síntese de eritrócitos) e transfusões sanguíneas^{1, 3}. Estas práticas só deixaram de existir em 1988, quando laboratórios desenvolveram uma forma sintética de eritropoetina⁴. A partir disto, as atenções de organizações esportivas de todo o mundo se voltaram para este tipo de doping, e técnicas de detecção para esta droga foram, e continuam sendo, produzidas. Além disto, entidades esportivas se empenham para elaboração de programas de conscientização e orientação dos atletas a respeito dos perigos desta prática.

Eritropoetina endógena

    A eritropoetina (EPO) é um hormônio endógeno glicoprotéico de origem renal (90%) e hepática (10%) nos adultos e somente hepática no período embrionário^{5, 6}. É composta por 165 aminoácidos e de duas a quatro cadeias sialiladas podem estar presentes em sua estrutura, devido aos três sítios de glicosilação N-ligados e à cadeia O-ligada que possui^{7, 8}. Esses resíduos de ácido siálico constituem um sinalizador biológico da EPO, a fim de evitar que esta seja depurada pelo fígado antes que alcance seu alvo fisiológico². Sua estrutura pode ser visualizada na figura 1. Também, devido aos resíduos de ácido N-acetilneuramínico (ácido siálico) que possui nas extremidades de cadeias glicídicas, a EPO possui carga negativa e um ponto isoelétrico (pI) que varia em torno de 4,5 a 5 ^{10, 11}.

Figura 1. Estrutura química da EPO, uma glicoproteína com peso molecular de 160000 Da com 166 aminoácidos e duas 

pontes dissulfídricas. Possui duas subunidades a e β. A EPO é composta por vários carboidratos e oligossacarídeos ligados.⁹

    Este hormônio é o principal regulador da eritropoiese, estimulando a proliferação dos precursores eritróides medulares (figura 2), diminuindo seu tempo de maturação e, consequentemente, ocasionando um aumento da liberação de reticulócitos na corrente sanguínea, além de inibir a apoptose celular¹³. Sua síntese é estimulada perante um estado de hipóxia tecidual, já que é responsável pela diferenciação das células designadas ao transporte de oxigênio tecidual, os eritrócitos¹⁴. Quando esta baixa oxigenação tecidual mostra-se presente, a EPO é sintetizada e carreada pela corrente sanguínea até a medula óssea, ocasionando um aumento de eritrócitos na circulação. Em relação a este aumento eritróide, observa-se que ocorre em cerca de um a dois dias após o pico plasmático da EPO^{15, 16}.

    Desta forma, acredita-se que este hormônio atue sobre células próximas dos eritrócitos maturados, provavelmente as células formadoras de colônias de eritrócitos^{1, 2} e sabe-se que estas só respondem à EPO . Estudos mostram que, nestas células, o número de receptores para EPO é inferior a mil e, nos reticulócitos e hemácias maduras, eles não se encontram presentes^{1, 15}. Estima-se que a meia-vida da eritropoetina, após o lançamento no sangue, seja de seis a oito horas e que seus níveis plasmáticos, no organismo humano, estejam em torno de 6,2 mU/mL (± 4,3)^{1, 2}.

Figura 2. Sequência de proliferação, manutenção e maturação das células hematopoéticas ao nível da medula óssea, 

a partir da célula tronco, com algumas FCHs envolvidas na sequencia de maturação da série mielóide. A EPO está envolvida 

na seqüência de aparecimento das células da linhagem eritróide originado reticulócitos que originaram hemácias maduras.¹²

Eritropoetina Humana Recombinante (rHuEPO) e isoformas da EPO

    EPO recombinante humana é uma glicoproteína altamente purificada, idêntica na seqüência de aminoácidos de eritropoetina endógena, produzida em escala elevada comercialmente graças ao advento da engenharia genética². A EPO recombinante contém até 14 ácidos siálicos necessários para que o hormônio atinja os sítios-alvos na medula óssea, evitando a rápida metabolização hepática, influenciando, portanto, a meia-vida biológica na circulação e na eficácia terapêutica⁴.

    A rHuEPO é utilizada para tratamento da anemia causada por insuficiência renal, restabelece os níveis de energia, melhorando qualidade de vida e tempo de sobrevida do paciente. Ultimamente está sendo utilizada em outros tipos de anemia, como as resultantes de pacientes submetidos a cirurgias¹⁷, pós-quimioterapia, associada ao HIV¹⁸ e anemia causada por neoplasias hematológicas, como o mieloma múltiplo¹⁹.

    Atualmente, estudos com a rHuEPO estão sendo feitos para sua aplicação na redução da inflamação associada à isquemia em casos de lesão cerebral, da coluna vertebral, insuficiência renal aguda e infarto do miocárdio²⁰.

    Entretanto, a EPO aumenta acentuadamente a ativação endotelial e a reatividade plaquetária. O uso indevido por pessoas saudáveis pode conduzir a um aumento excessivo na hemoglobina, aumentando a viscosidade sanguínea, e por conseqüência, aumentando o hematócrito. Isso pode estar associado a complicações tromboembólicas, tais como isquemia e infarto do miocárdio, hemorragia cerebral e infarto, isquemia transitória, trombose venosa profunda, trombose arterial, embolia pulmonar, e trombose da retina^{2, 21} . Também está relatado aumento da pressão arterial, porém o mecanismo fisiopatológico desta elevação pressórica ainda não está esclarecido, e aumento do risco de desenvolver carcinoma hepático. Todavia, os efeitos em longo prazo ainda não são conhecidos, mas acredita-se haver um risco de desenvolvimento de desordens mieloproliferativas¹⁷.

    Indivíduos que utilizam da rHuEPO podem desenvolver durante o tratamento uma deficiência de ferro, conseqüência do aumento da taxa de produção dos glóbulos vermelhos; neste caso, recomenda-se uma suplementação de ferro durante o tratamento com rHuEPO¹⁷.

    As EPOs recombinantes são provenientes de diferente fontes de síntese em diferentes regiões do mundo², desta forma são observadas diferenças significativas entre a composição de isoformas, propriedades biológicas e farmacocinéticas das rHuEPOs²². Estas diferenças devem-se a micro-heterogeneidade na estrutura do hormônio provocada pela variação na composição polissacarídica. Atualmente a rHuEPO está disponível para o uso terapêutico no mercado farmacêutico sob as formas: epoetina a, epoetina β, epoetina Ω². Elas são classificadas de acordo com o método de fabricação, sendo as duas primeiras produzidas a partir do clone do gene humano da EPO expresso em células de ovário de hamster Chinês (CHO) e a última em células do rim de hamster jovem (BHK)⁷.

    Um análogo a EPO recombinante humana foi desenvolvido por EGRIE & BROWNE (2001), a darbepoetina a (Aranesp®) uma versão hiperglicosilada da rHuEPO, a fim de demonstrar que com mais cadeias de carboidratos, a nova molécula apresentaria maior atividade biológica.

    Na prática clínica, as vias intravenosa, subcutânea e intraperitoneal são as formas de administração mais comuns de rHuEPO. A escolha da via depende de considerações farmacocinéticas aliadas a aspectos de ordem prática². Porém a melhor relação custo-benefício é a administração subcutânea subdividida em duas ou três vezes por semana²³. Verifica-se que a eritropoiese é mais eficaz em resposta a injeções freqüentes com doses fracionadas de rHuEPO do que por picos intermitentes com grande dosagens. Entretanto, nenhuma das modalidades ou vias de administração exógena consegue reproduzir o padrão fisiológico de secreção ou ritmo circadiano do hormônio natural².

    Estudos demonstraram que o tempo de meia-vida na circulação da rHuEPO a após administração intravenosa é de 4 a 11 horas. A biodisponibilidade após administração subcutânea foi de 21% e o tempo para atingir a concentração máxima de 18 horas. Já a rHuEPO ß apresentou um tempo de meia-vida 20% superior à a após a administração intravenosa, e após administração subcutânea apresentou uma contagem absoluta de reticulócitos bem superior²². A versão análoga à rHuEPO, a darbepoetina, demonstrou meia-vida biológica no soro, aproximadamente três vezes superior, assim obtendo-se a mesma resposta biológica com menor freqüência na administração²⁴.

Detecção laboratorial da rHuEPO e de outras formas sintéticas de EPO

    Durante muito tempo, a detecção laboratorial da rHuEPO em atletas, assim como as outras formas de eritropoetina sintética, era algo impossível de se realizar, devido ao fato desta substância ser estruturalmente complexa e de elevada massa molecular, estar presente em baixas concentrações nos fluidos biológicos e ser bastante semelhante à forma endógena^{25, 26}.

    Desde 1990, a rHuEPO é oficialmente proibida pelo Comitê Olímpico Internacional, sendo que o primeiro teste para detecção deste hormônio sintético só foi realizado em 2000, nos Jogos Olímpicos de Sydney²⁷. Atualmente, os únicos métodos para detecção da rHuEPO aceitos pela Agência Mundial Anti-Doping (World Anti-Doping Agency – WADA) são a focalização isolelétrica e double blotting, mesmo sabendo-se que estas metodologias não são totalmente eficazes na detecção de isoformas deste hormônio sintético e que possuem poucas chances de identificar algum resíduo de substância ilegal em amostra de uma pessoa que há alguns dias finalizou o uso da droga^{27, 28}.

    Além disto, muitas instituições também se valem da observação de índices hematimétricos, como valores de hematócrito, hemoglobina, presença de reticulocitose de macrocitose (achados que indicam eritropoiese acelerada) para avaliar os atletas submetidos à análise anti-doping². A União Internacional de Ciclismo e a União Internacional de Esqui, por exemplo, em relação aos índices hematimétricos, estabeleceram valores máximos de hematócrito e hemoglobina: 50% e 17 g/dL, respectivamente, para mulheres, e 50% e 18,5g/dL para homens¹⁷.

    Em relação aos índices hematimétricos, existem dois modelos matemáticos para sua utilização: o ON (destinado a usuários recorrentes de rHuEPO) e o OFF (para possível identificação de um atleta que suspendeu a utilização da EPO recentemente^{26, 29, 30}. Apesar disto, sabe-se que não são boas fontes confirmatórias de doping, já que esses valores, por sofrerem alteração de diversas variáveis (como exemplo, a altitude do local onde o esportista reside e/ou treina) podem diferir muito de um indivíduo para o outro. Porém, as provas laboratoriais, mesmo que com algumas deficiências, são capazes de detectar grande número de amostras que possuem indícios de uso de EPO sintética pelo doador do material biológico.

    O método considerado padrão-ouro para detecção da rHuEPO, principalmente, além da darbepoetina e outras isoformas, é a Focalização Isoelétrica seguida de Double Blotting, em amostra urinária^{2, 27, 31}. Este método torna possível a identificação de formas sintéticas da EPO devido à diferença de pH , está baseado em diferenças existentes entre os resíduos de carboidratos da rHuEPO e da EPO fisiológica. Na focalização isoelétrica, a eritropoetina endógena apresenta bandas, com pH de 3,92 a 4,42, enquanto que as formas a e ß de rHuEPO apresentam pI na faixa de 4,42 a 5,11 e a darbepoetina tem seus valores de pI em torno de 3.7 – 4^{27, 32}. A figura 3 ilustra diferentes bandas de formas sintéticas de EPO.

Figura 3. Imagem das diferentes bandas obtidas através de quimiluminescência em análise de eritropoetina. ³¹

    Apesar de esta metodologia possuir uma fundamentação consistente, ainda sofre com muitos interferentes e variáveis. A exemplo disto, temos o atleta que, em torno de uma semana antes da avaliação, cessa o uso da EPO sintética. Como esta possui uma meia-vida pouco considerável no plasma sanguíneo, o infrator tem grandes chances de não ser identificado por seu ato, já que a metodologia utilizada pode não ser capaz de identificar a substância do doping².

    Não obstante a estes pontos defasados, a identificação laboratorial da EPO está em constante desenvolvimento, e formas, que não o padrão-ouro, tem mostrado igual eficácia nos resultados. Inúmeros estudos publicados conotam a diversas outras metodologias que, comprovadamente, realizam a detecção da EPO sintética. A exemplo disto, temos testes baseados em anticorpos mono ou policlonais anti-EPO humana, utilização de marcadores fisiológicos, investigação por cromatografia líquida, análise de marcadores gênicos eritróides, entre muitos outros^{2, 7, 28, 33}.

Dados estatísticos relacionados ao doping por eritropoetina

    A Agência Mundial Anti-Doping (World Anti-Doping Agency – WADA), responsável por normatizar a metodologia de detecção da eritropoetina sintética em atletas praticantes de diversas modalidades esportivas, disponibiliza, periodicamente, documentos que fornecem dados acerca da estatística referente ao o uso desta substância de forma ilegal.

    Este trabalho, mostra dados retrospectivos da utilização da rHuEPO no período de 2003 a 2007, e analisa se um decréscimo de seu uso está ocorrendo ou não, já que campanhas de conscientização sobre os efeitos adversos de seu uso indevido vem sendo realizadas por diversos órgãos internacionais¹⁷.

• 2003: amostras de 151.210 atletas, de diversas partes do mundo e praticantes das mais diversas modalidades esportivas, foram analisadas, sendo que destas, 2716 continham alguma substância ilegal. Destas amostras com resquícios de ilegalidade, um total de 79 apresentou positividade para presença de hormônios peptídicos (grupo no qual se encontra a rHuEPO – S5), o que corresponde a 2,9% do total de testes positivos realizados. A representatividade da eritropoetina e darbepoetina no grupo S5 foi, respectivamente, de 64,6% e 8,9%, geradas a partir de 51 e 7 amostras de cada substância, conforme mostra a tabela 1³¹.

• 2004: amostras de 169.187 atletas de modalidades olímpicas e não olímpicas foram analisadas, com positividade de doping em 3305. Destas 3305, 78 foram positivas para hormônios peptídicos (grupo S5) , correspondendo a 2,4% do total dos testes. Dentre estas amostras do grupo S5, a eritropoetina contribui com 48,7%, ou seja, 38 amostras. Estes dados podem ser observados na tabela 2³¹.

• 2005: das 183.337 amostras analisadas, 4298 foram positivas para substâncias ilegais. Dentre estas, 3,8% (162 amostras) pertenciam ao grupo de hormônios (S2), no qual se encontra a eritropoetina e a darbepoetina. A EPO, no grupo S2, representou 9,3% (15 amostras) das amostras positivas, enquanto que a darbepoetina contribuiu com apenas 0,6% (1 amostra), o que fica evidenciado na tabela 3³¹.

• 2006: 198.143 atletas foram testados em relação à presença de substâncias ilícitas, com resultados positivos em 4332. Destes positivos, apenas 1% (42 amostras) foram relacionadas a hormônios (grupo S2). A eritropoetina, com 17 amostras, representou 40,5% deste grupo e, com uma amostra, a darbepoetina correspondeu a 2,4%., conforme pode ser confirmado na tabela 4³¹.

• 2007: amostras de 223.898 atletas, de diversas modalidades esportivas, foram analisadas, sendo que 4850 continham alguma substância ilegal. Destas amostras, 41 apresentaram positividade para presença de hormônios peptídicos (grupo no qual se encontra a rHuEPO – S2), o que corresponde a 0,8% do total de testes positivos realizados. A representatividade da eritropoetina e darbepoetina no grupo S2 foi, respectivamente, de 53,7% e 4,9%, geradas a partir de 22 e 2 amostras de cada substância, conforme mostra a tabela 5³¹

Conclusão e implicações para o futuro

    Mesmo possuindo um potencial de causar riscos à saúde, formas exógenas de eritropoetina, que proporcionam melhora no condicionamento físico devido à influência sobre o sistema hematopoiético, são usadas por atletas que visam melhores resultados na prática esportiva, principalmente em modalidades de “endurance” ¹.

    Com o intuito de controlar este tipo de doping, várias organizações mundiais desenvolvem estratégias para prevenir e detectar de forma eficaz a presença de EPO sintética. Porém, ainda há muito que se descobrir e aplicar. Técnicas recentes como o doping genético, onde uma cópia do gene que codifica a eritropoetina é adicionado no esportista, são praticamente indetectáveis, embora alguns estudos sugerem que é possível diferenciar, por meio do padrão de glicosilação protéico, a eritropoetina produzida pelo gene nativo da produzida pelo gene transferido^{34, 35, 36}.

A partir da análise dos dados fornecidos pelas tabelas 1 – 4 se observa uma diminuição de resultados positivos para doping por formas clássicas de EPO exógena. Porém, novas metodologias ilícitas para melhora na performance surgem periodicamente, enquanto que as técnicas continuam defasadas, e necessitam cada vez mais serem aperfeiçoadas para se obter uma maior confiabilidade dos resultados obtidos^{2, 37, 31}. 

Tabela 1. Dados fornecidos pela WADA referentes aos resultados de testes anti-doping realizados no ano de 2003 ³¹

 

Tabela 2. Dados fornecidos pela WADA referentes aos resultados de testes anti-doping realizados no ano de 2004 ³¹

 

Tabela 3. Dados fornecidos pela WADA referentes aos resultados de testes anti-doping realizados no ano de 2005 ³¹

 

Tabela 4. Dados fornecidos pela WADA referentes aos resultados de testes anti-doping realizados no ano de 2006 ³¹

 

Tabela 5. Dados fornecidos pela WADA referentes aos resultados de testes anti-doping realizados no ano de 2007 ³¹

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